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亚细胞结构分离的技术

细胞由各种亚细胞结构组成。其重要的研究手段之一是分离纯化亚细胞组分,观察它们的结构或进行生化分析。离心技术是实现这一目标的基本手段。
分离亚细胞组分的第一步是制备组织匀浆或细胞匀浆。匀浆(Homogenization)是在低温条件下,将组织或细胞放在匀浆器中加入等渗匀浆介质(即0.25moL/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液)研磨,使细胞被机械地研碎成为各种亚细胞组分和包含物的混合物。
分离亚细胞组分的第一步是分级分离。它通过由低速到高速离心技术,使非均一混合体中的颗粒按其大小轻重分批沉降到离心管的不同部位,再分部收集,即可得到各种亚细胞组分。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时是均匀分布于整个离心管中,故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒,须经反复悬浮和离心加以纯化。分离亚细胞组分主要离心技术是差速离心和密度梯度离心。
差速离心(differential centrifugation)是在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心,用于分离不同大小的细胞和细胞器。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为:细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核糖体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠,一般重复2~3次效果会好一些。通过差速离心可将细胞器初步分离,但常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
密度梯度离心(density gradient centrifugation) 是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求:能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高; pH中性或易调为中性;浓度大时渗透压不大;对细胞无毒。①速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种方法所采用的介质密度较低,介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒(细胞或细器)在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离;②等密度沉降(isopycnic sedimentation)适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处,并停留在那里达到平衡,从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。再者,这种方法所需要的力场通常比速度沉降法大10~100倍,故往往需要高速或超速离心,离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。因此,这种方法适于分离细胞器,而不太适于分离和纯化细胞。
分离亚细胞组分的第三步是对分级分离得到的组分进行分析,以确认。常要的分析方法包括形态和功能鉴定。